在戰(zhàn)爭(zhēng)、疫情等不可抗力因素之外，全球城市化率和人口增長(zhǎng)的提高、糧食生產(chǎn)與消費(fèi)比例的大幅下降、全球氣候變化可能引起的非生物脅迫、植物全球流行病的潛在威脅等因素也在影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。一萬(wàn)年來(lái)，科學(xué)家和育種學(xué)家們一直致力于開(kāi)發(fā)和改良農(nóng)作物。目前，用100年前相同數(shù)量的土地可以供養(yǎng)之前10倍多的人口。育種對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量的定向進(jìn)化，以及確保糧食供應(yīng)和安全方面都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

農(nóng)作物育種的發(fā)展

早期作物馴化基于表型篩選，分子機(jī)理未明。19世紀(jì)孟德?tīng)柖山沂净蚩刂菩誀睿苿?dòng)雜交育種興起，結(jié)合優(yōu)良性狀。隨后，雜交、誘變、轉(zhuǎn)基因技術(shù)引領(lǐng)現(xiàn)代定向育種。分子生物學(xué)與測(cè)序技術(shù)革新，引領(lǐng)作物育種進(jìn)入分子時(shí)代，NGS技術(shù)積累大數(shù)據(jù)，促進(jìn)基因功能研究。高密度分子標(biāo)記助力農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析，指導(dǎo)分子育種。多組學(xué)技術(shù)深化作物發(fā)育理解。CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)突破，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因調(diào)控，提升作物產(chǎn)量、質(zhì)量及抗逆性，且操作簡(jiǎn)便高效，開(kāi)啟精準(zhǔn)分子育種新紀(jì)元。

 Int J Mol Sci. 2020 Apr; 21(7): 2590

CRISPR/Cas基因編輯

與農(nóng)作物育種

CRISPR/Cas基因編輯具有許多潛在的應(yīng)用，如基因敲除、敲入、基因突變、堿基編輯以及CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因調(diào)控和表觀基因組編輯。

CRISPR/CAS基因組編輯在基因功能研究中的應(yīng)用【1】

基因敲除是CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的主要應(yīng)用之一，已廣泛用于多種植物物種中單個(gè)基因的敲除。其優(yōu)勢(shì)在于基因編輯的特異性，快速而精確地沉默單個(gè)基因，而沒(méi)有其他副作用。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于研究基因功能或消除由特定基因控制的一些不良性狀非常有用。

基因敲入或替換利用CRISPR/Cas9技術(shù)切割DNA后，通過(guò)同源重組將外源基因定點(diǎn)插入基因組。盡管長(zhǎng)序列插入在植物中仍具挑戰(zhàn)，但研究者正探索提高效率的方法。哈佛大學(xué)的prime編輯技術(shù)（2019年）利用nCas9與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，結(jié)合pegRNA，實(shí)現(xiàn)基因修復(fù)與替換，已成功應(yīng)用于水稻、小麥等多種農(nóng)作物。同時(shí)，CRISPR/Cas堿基編輯技術(shù)也迅速發(fā)展，通過(guò)nCas9或dCas9在gRNA的幫助下結(jié)合特定DNA序列，融合堿基轉(zhuǎn)換酶（如胞苷脫氨酶（CD）將C轉(zhuǎn)T，腺嘌呤脫氨酶（AD）將A轉(zhuǎn)G）以修復(fù)點(diǎn)突變，特別是CD介導(dǎo)的編輯在小麥、玉米等作物中研究深入。

CRISPR/Cas基因編輯

在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用

CRISPR/Cas基因編輯已成為成熟的尖端生物技術(shù)改良工具，應(yīng)用于作物的各種性狀改良，包括病原體抗性、非生物耐受性、植物發(fā)育和形態(tài)、次級(jí)代謝等。同時(shí)，CRISPR/Cas基因編輯還被用于研究農(nóng)作物馴化，賦予特定農(nóng)作物的某些獨(dú)特性狀。

CRISPR/CAS基因組編輯在作物改良中的應(yīng)用【1】

a.提高作物產(chǎn)量

提高作物產(chǎn)量是由多個(gè)基因和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所控制的，CRISPR/Cas基因編輯正在成為一種提高作物產(chǎn)量的精準(zhǔn)育種新方法。通過(guò)敲除水稻中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，如gn1a、dep1、gs3等，增強(qiáng)了粒級(jí)、粒重、粒數(shù)、致密和直立的圓錐花序等產(chǎn)量相關(guān)性狀。此外，通過(guò)編輯與谷物重量相關(guān)的gw2、gw5和tgw6調(diào)控因子，突變體表現(xiàn)出谷物重量和大小的顯著增加；而敲除vin2基因，突變體會(huì)表現(xiàn)出種子大小和粒重的減小。

b.改善植物生長(zhǎng)發(fā)育

CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)已成為研究植物生長(zhǎng)發(fā)育功能、改善植物形態(tài)以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要工具。研究人員采用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)證明了MADS轉(zhuǎn)錄因子基因MADS78和MADS79在水稻胚乳細(xì)胞化和早期種子發(fā)育中的基本調(diào)控功能。同時(shí)，由CRISPR/Cas9編輯的水稻己糖激酶hxk5基因突變體會(huì)導(dǎo)致水稻雄性不育。

c. 改善次生代謝和作物質(zhì)量

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)被用于探索改變植物次級(jí)代謝以提高作物質(zhì)量的可能性。例如，通過(guò)對(duì)α-麥醇溶蛋白基因進(jìn)行編輯，研究人員獲得了低筋無(wú)轉(zhuǎn)基因的小麥，d-hordein基因敲除優(yōu)化大麥蛋白基質(zhì)。此外，利用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)成功敲除淀粉分支酶（SBE）基因SBEIIb，并生成了具有高直鏈淀粉含量的基因組編輯水稻，其中直鏈淀粉含量高達(dá)25%，長(zhǎng)鏈比例更高。

d.增強(qiáng)作物抗病抗蟲(chóng)能力

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已被迅速應(yīng)用于增強(qiáng)農(nóng)作物對(duì)真菌、病毒和細(xì)菌所引起疾病的抵抗力。例如，通過(guò)敲除六倍體面包小麥中的MLO基因，賦予小麥對(duì)白粉病的抗性；通過(guò)敲除水稻中的Os8n3基因，測(cè)試發(fā)現(xiàn)編輯后的水稻表現(xiàn)出對(duì)黃單胞菌感染具有顯著的抵抗力。

e.提高非生物脅迫的耐受性

隨著全球氣候的變化，非生物脅迫對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的影響越來(lái)越嚴(yán)重。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)提高對(duì)非生物脅迫的耐受性主要體現(xiàn)在對(duì)非編碼基因的調(diào)控。例如，在玉米中，通過(guò)編輯玉米體內(nèi)與乙烯反應(yīng)相關(guān)的負(fù)調(diào)節(jié)因子AGROS8，可增強(qiáng)玉米對(duì)干旱的耐受性；CRISPR/Cas編輯產(chǎn)生的G蛋白基因gs3和dep1突變體，增強(qiáng)了水稻對(duì)鹽脅迫的耐受性；ppa6基因的敲除增強(qiáng)了水稻對(duì)堿性脅迫的耐受性等。

泓迅生物

DNA“讀”“寫”“編”一站式解決方案

泓迅生物自2013年成立以來(lái)，結(jié)合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、人工智能與機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，構(gòu)建了全球領(lǐng)先的“讀”、“寫”、“編”一站式平臺(tái)。公司擁有近十年的農(nóng)作物全基因組CRISPR sgRNA設(shè)計(jì)與文庫(kù)合成經(jīng)驗(yàn)，覆蓋水稻、小麥、玉米等十余種作物，幫助客戶獲取關(guān)鍵基因信息，加速遺傳多樣性研究和縮短育種周期。我們將利用高效合成生物學(xué)平臺(tái)和先進(jìn)生物設(shè)計(jì)及AI預(yù)測(cè)，為基因編輯在農(nóng)作物育種的研究和商業(yè)化提供專業(yè)服務(wù)，并致力于建立中國(guó)最強(qiáng)的育種庫(kù)。

 泓迅生物CRISPR sgRNA設(shè)計(jì)案例匯總

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang D, Zhang Z, Unver T, Zhang B. CRISPR/Cas: A powerful tool for gene function study and crop improvement. J Adv Res. 2020;29:207-221. Published 2020 Oct 21.

[2] Ahmar S, Gill RA, Jung KH, et al. Conventional and Molecular Techniques from Simple Breeding to Speed Breeding in Crop Plants: Recent Advances and Future Outlook. Int J Mol Sci. 2020;21(7):2590. Published 2020 Apr 8.

[3] 全球糧食危機(jī)要來(lái)！？多國(guó)發(fā)出警告，歐美已在行動(dòng)…國(guó)內(nèi)飼料庫(kù)存緊張連續(xù)5次提價(jià)，新浪財(cái)經(jīng)，2022年03月30日