主要元件組成：復制起始點、多克隆位點及抗性篩選基因。

主要功能與應(yīng)用：用于DNA復制與擴增。

主要元件組成：除了克隆載體的基本元件，還須具備轉(zhuǎn)錄/翻譯所必須的DNA元件，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止信號。啟動子驅(qū)動目標基因轉(zhuǎn)錄生成RNA，合成的RNA在轉(zhuǎn)錄終止信號下停止轉(zhuǎn)錄。

（1）根據(jù)啟動子類型可分為組成型表達載體、組織特異性表達載體和誘導表達載體，比較如下：

（2）根據(jù)啟動子來源可分為哺乳動物表達載體、酵母表達載體、大腸桿菌表達載體等。

（3）根據(jù)目標基因類型可分為常規(guī)基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體、抗體蛋白表達載體等。

常規(guī)基因表達載體、重組蛋白表達載體、非編碼RNA表達載體及抗體蛋白表達載體比較如下：

主要功能與應(yīng)用：

（1）基因表達與功能研究：在特定宿主細胞中表達目標基因，并研究該基因在宿主細胞中的功能。這種技術(shù)對于理解基因在生物體內(nèi)的作用機制、基因功能發(fā)現(xiàn)等具有重要意義。

（2）蛋白生產(chǎn)：用于生產(chǎn)具有特定功能的蛋白質(zhì)。通過選擇適當?shù)乃拗骷毎捅磉_載體，可以高效地表達并純化目標蛋白，用于生物制藥、診斷試劑、工業(yè)酶等領(lǐng)域。

（3）基因療法：在基因治療領(lǐng)域，表達載體可將正常的基因?qū)氲交颊叩募毎校蕴鎿Q或修復缺陷基因。通過這種表達載體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，可以實現(xiàn)基因在患者細胞中的長期、穩(wěn)定表達，從而達到治療疾病的目的。

（4）疫苗開發(fā)：表達載體將抗原基因?qū)胩囟ㄋ拗骷毎斜磉_，誘發(fā)免疫反應(yīng)可以制備出具有免疫原性的抗原蛋白。這些抗原蛋白可以用于制備疫苗，預防和控制傳染病的發(fā)生。

編輯載體（Editing Vector）是一種用于基因編輯的分子工具，它通常基于質(zhì)粒（plasmid）或其他DNA載體系統(tǒng)，并攜帶特定的基因編輯元件，如DNA核酸酶、識別序列以及模板DNA等，用于在目標生物體的基因組中進行精確的DNA序列修改。編輯載體的設(shè)計和構(gòu)建需要高度的專業(yè)知識和技能，以確保編輯的精確性和效率。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，編輯載體在生物醫(yī)學研究、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景越來越廣闊。

主要功能與應(yīng)用：

（1）基因敲除：通過DNA核酸酶在特定位置切割DNA，然后依賴細胞的DNA修復機制（如非同源末端連接）來刪除或破壞基因。

（2）基因敲入：在DNA切割后，通過提供模板DNA來引導細胞進行同源重組，從而在特定位置插入新的DNA序列。

（3）基因修復：類似于基因敲入，但用于修復已存在的突變或缺陷。

根據(jù)編輯對象不同，主要分為CRISPR Cas9敲除載體和CRISPR Cas13敲除載體，比較如下表：

表達調(diào)控載體通常包含啟動子、增強子、沉默子等必須的順式調(diào)控元件，以及一個或多個用于插入目標基因的多克隆位點。通過設(shè)計這些調(diào)控元件，研究人員可以精確地控制目標基因在特定時間、特定組織或特定條件下的表達水平。

主要功能與應(yīng)用：

（1）基礎(chǔ)科學研究：通過構(gòu)建表達調(diào)控載體，可以精確地控制目標基因在特定時間或特定細胞類型中的表達，從而深入研究該基因在生物體中的功能。

（2）代謝工程：通過精確控制關(guān)鍵酶的表達水平，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量或改變其代謝產(chǎn)物的比例。

（3）醫(yī)藥研發(fā)：通過調(diào)控治療基因的表達來糾正或補償缺陷基因的功能，實現(xiàn)疾病的基因治療。

（4）作物改良：通過提高抗旱、抗病或抗蟲基因的表達水平，增強作物的抗逆性。

　根據(jù)調(diào)控表達形式主要分為CRISPRi載體及CRISPRa載體。詳情如下表：

體外轉(zhuǎn)錄（In Vitro Transcription，IVT）載體，又稱為無細胞轉(zhuǎn)錄載體，是一種在實驗室條件下，利用純化的DNA作為模板，在試管或其他容器中進行的RNA合成過程。主要用于生產(chǎn)和研究RNA分子。

主要功能與應(yīng)用：

（1）mRNA疫苗和免疫治療：通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，可以制備出編碼特定抗原的mRNA，這些mRNA可以在體內(nèi)被細胞攝取并翻譯成蛋白質(zhì)，從而誘導機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種傳染病和腫瘤的疫苗研發(fā)中。

（2）基因功能研究：在分子生物學和生物技術(shù)的基礎(chǔ)研究和教學領(lǐng)域，體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)是一種重要的實驗工具。通過體外轉(zhuǎn)錄實驗，可以幫助學生和研究人員更深入地理解RNA的合成、加工和功能機制。

（3）生物合成和代謝工程：用于生產(chǎn)具有特定功能的RNA分子，如RNA酶、RNA適配體等。這些RNA可以用于生產(chǎn)特定的生物活性物質(zhì)或調(diào)節(jié)代謝途徑。

（4）診斷與檢測：還可以用于生產(chǎn)標記有放射性同位素或其他探針的RNA分子，通過檢測特定RNA分子的表達水平或結(jié)構(gòu)變化，可以判斷疾病的發(fā)病機制和病情進展。

根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同主要分為RNA體外轉(zhuǎn)錄載體和mRNA體外轉(zhuǎn)錄載體。詳情如下表：

優(yōu)勢：

（1）高效快速：可以在短時間內(nèi)合成出大量的RNA/mRNA分子，滿足實驗需求。

（2）高純度：通過體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成的RNA/mRNA分子純度高，不需要經(jīng)過復雜的分離和純化步驟。

（3）靈活性：可以合成各種長度和序列的RNA/mRNA分子，適用于不同的實驗需求。

（4）可控性強：體外轉(zhuǎn)錄過程可以在實驗室內(nèi)進行控制，可以根據(jù)實驗需要調(diào)整反應(yīng)條件和時間。

（5）適用于大規(guī)模生產(chǎn)：由于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的高效性和可控性，它適用于大規(guī)模生產(chǎn)RNA分子，如mRNA疫苗的生產(chǎn)等。

限制：

（1）穩(wěn)定性受限：體外轉(zhuǎn)錄的RNA/mRNA分子在保存和運輸過程中可能受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，導致穩(wěn)定性下降。

（2）可能產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物：在體外轉(zhuǎn)錄過程中，可能會產(chǎn)生一些非特異性的RNA產(chǎn)物，影響實驗結(jié)果的準確性。

（3）不適用于所有類型的RNA合成：雖然體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以合成多種類型的RNA分子，但對于某些特殊的RNA結(jié)構(gòu)或功能可能無法實現(xiàn)有效合成。

啟動子功能檢測載體將目標啟動子序列與報告基因（熒光蛋白、酶等）相連，并將其導入到目標細胞或組織中。當啟動子被激活時，會驅(qū)動報告基因的表達，通過觀察報告基因的表達情況來評估啟動子的活性。

關(guān)鍵元件：

一個啟動子插入位點及供啟動子驅(qū)動表達的報告基因，以及必要的調(diào)控序列和標記基因。

特點：

報告基因多樣：通常包含一個或多個報告基因，如熒光素酶或綠色熒光蛋白（GFP），用于衡量啟動子的活性。

應(yīng)用優(yōu)勢：

（1）快速篩選：能夠快速識別和評估啟動子的活性。

（2）定量分析：報告基因的表達水平可以量化，便于比較不同啟動子的效率。

（3）多樣性評估：適用于多種研究應(yīng)用，包括啟動子鑒定、功能分析和優(yōu)化。

（4）技術(shù)成熟：利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件活性及結(jié)合位點預測等實驗設(shè)計思路與細節(jié)已經(jīng)非常成熟。

應(yīng)用限制：

（1）背景噪聲：某些載體可能存在非特異性表達，導致背景噪聲。

（2）宿主限制：啟動子的活性可能受到宿主細胞類型的影響。

（3）成本：購買或構(gòu)建高特異性的檢測載體可能成本較高。

蛋白互作檢測通常通過構(gòu)建融合蛋白表達載體來實現(xiàn)，其中目標蛋白序列與報告基因或標簽序列融合，并在宿主細胞中共表達這兩個融合蛋白。當這兩個融合蛋白發(fā)生相互作用時，它們能夠激活或抑制與它們相連的報告基因，從而引發(fā)可測量的信號變化，如熒光強度的增強或顏色的改變。通過檢測這些信號變化，研究人員能夠評估并量化蛋白質(zhì)之間的相互作用。

關(guān)鍵元件：

目標基因插入位點、用于報告蛋白互作的報告系統(tǒng)元件。

特點：

（1）雙報告基因系統(tǒng)：通常包含兩個報告基因，用于監(jiān)測蛋白間的相互作用。

（2）融合標簽：載體設(shè)計包含融合蛋白標簽，如GST、His或Flag，便于蛋白的純化和檢測。

（3）信號放大：一些載體通過信號放大機制提高檢測的靈敏度。

優(yōu)勢：

（1）實時監(jiān)測：可以實時監(jiān)測蛋白互作的動態(tài)過程。

（2）定量分析：提供了一種定量分析蛋白互作強度的方法。

（3）高通量篩選：適用于大規(guī)模篩選實驗，有助于快速識別互作蛋白。

（4）應(yīng)用廣泛：可用于藥物篩選、疾病機制研究和信號傳導途徑分析。

限制：

（1）假陽性/假陰性：可能由于非特異性結(jié)合或?qū)嶒灄l件不當導致錯誤結(jié)果。

（2）局限性：蛋白互作檢測載體通常只能檢測到已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，對于未知的蛋白質(zhì)相互作用可能無法檢測。此外，一些低親和力或瞬時的蛋白質(zhì)相互作用也可能無法被檢測到。